科普:韓春雨《自然-生物技術》論文研究到底是創新還是出錯?NgAgo到底是什么"嗯雞阿狗"?

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樓主 2020-05-11 09:00:06
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蝌蚪士編者按》?2016年5月2日,河北科技大學青科副教授韓春雨作為通訊作者在國際學術期刊《自然-生物技術》上發表論文,稱發現一種能夠用于哺乳動物基因編輯的核酸酶,即NgAgo(音譯:嗯雞阿狗),并宣稱NgAgo剪切基因的編輯功能遠比當今最為時興的CRISPR-Cas9(音譯:克里凱斯魔剪)基因編輯技術更精確、更通用、更高效。韓春雨的這一發現被一些領軍中國生命科學的“知識分子”視為諾獎級研究成果,從而引發媒體一片贊譽,韓春雨也由一個默默無聞的青科迅速成為耀眼的網紅科學家。但這一號稱諾獎級的發現不久就被全球多家實驗室跟進研究的失敗而引發質疑,而面對這些科學質疑,網紅期間表現得非常“瀟灑外向”而且“開朗健談”的韓春雨一下子變得“羞澀內向”而且“沉默寡言”,不僅不正面回答質疑,而且還稱因實驗室“貧窮”而實驗記錄不全、冰箱斷電而失去實驗材料重復實驗。如此不科學態度更加引發國內外科學界的批評與聲討。但有關方面面對一個尚未證實的科學發現卻表現出不負責任的大力支持,韓春雨不僅官運亨通(火箭般竄升為省科協副主席)而且財源滾滾(幾千萬的設備采購費和數億元的中心建設費即刻到齊)。而且這一切冒進行為并未因《自然-生物科技》發表的編輯部擔憂和最后通牒而有所收斂,反而有逆流而上之勢。

? ? ?因此,出于對中國真科原始創新的實際支持和對祖國寶貴科學財產的真心愛護,《蝌蚪士》將推出“韓劇演繹”和“韓果剖析”兩個系列,分別探討這場“五月春雨”的成因后果和韓式“基因剪刀”的真偽優劣。


韓果剖析:

韓式“基因剪刀”的真偽優劣

NgAgo到底是什么"嗯雞阿狗"?

(作者| 胡紹凡、塞德夫)

導讀:作為《蝌蚪士》的“韓果剖析”系列開篇,本文將就NgAgo(嗯雞阿狗)到底是什么和NgAgo(嗯雞阿狗)究竟有無基因編輯功能進行初步探討,以此拋磚引玉,期望更多辨別基因剪刀真假優劣的文章出現。


1.?? 什么是NgAgo?

NgAgo只是Argonaute (Ago)家族蛋白之一,因在Natronobacterium gregoryi細菌株中發現,所以稱作NgAgo。Argonaute大家可能比較大而陌生,但是RNAi干擾大家較為熟悉,在RNAi中與siRNA構成RISC的蛋白就屬于Argonaute蛋白家族。

Argonaute蛋白在20世紀90年代被Bohmert首次發現后,近年來得到了越來越多的研究者的關注。迄今為止,Argonaute被證實在蛋白在原核生物和真核生物中廣泛分布。Ago包含四個結構域:N端結構域、PAZ結構域、MID結構域以及PIWI結構域(少數原核生物Ago蛋白僅含有MID和PIWI結構域)。哺乳動物中的Ago蛋白主要分為4類:Ago1-Ago4,而在人類這四種Ago蛋白中只有Ago2具有切割活性,且只能在ssRNA的引導下才切割RNA。

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2.?? NgAgo的結構簡介

Ago蛋白呈雙葉型結構,一葉是包含PAZ結構域的N端(N和PAZ結構域),另一葉是包含PIWI結構域的C端(MID、L1和PAZ);這兩葉有L2連接起來,Ago蛋白能夠與起引導作用的核酸結合。其中,核酸的5'-磷酸化末端與3'-羥基末端分別錨定在MID和PAZ的口袋內,接著這個錨定的引導片段作為一個模板與靶向核酸片段配對。Ago殘基的切割活性是由PIWI來承擔的,PIWI是一個RNaseH類似的結構域,其催化活性中心為Asp-Asp-Asp/His三氨基酸。當結合上引導片段和靶片段后,首先會切割雙鏈復合體的siRNA片段,隨后切割靶片段,這一切割過程需要Mg+的參與。

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人類Ago2結構圖

(SchirleNT et al. doi: 10.1126/science.1221551)

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3.?? 簡介NgAgo功能假說

真核生物Argonaute蛋白是RNAi途徑中的關鍵蛋白,通過病毒基因、人工轉入基因、轉座子等外源性基因隨機整合到宿主細胞基因組內,并利用宿主細胞進行轉錄時,常產生一些dsRNA。反之,宿主細胞對這些dsRNA迅即產生反應,其胞質中的核酸內切酶Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和結構的小片段RNA(大約21~23 bp),即siRNA。隨后,siRNA在細胞內RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈,繼之由反義siRNA再與體內一些酶(包括內切酶、外切酶、解旋酶等)結合形成RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex,RISC)。RISC與外源性基因表達的mRNA的同源區進行特異性結合,RISC具有核酸酶的功能,在結合部位切割mRNA,切割位點即是與siRNA中反義鏈互補結合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解,從而誘發宿主細胞針對這些mRNA的降解反應。

原核細胞中也存在Argonaute,但是原核生物中缺乏RNA干擾相關的蛋白。不過原核生物的Argonaute同樣具有切割核酸的能力,并且其不僅可以利用ssRNA來切割DNA/RNA,也可利用ssDNA為引導分子來切割DNA/RNA。例如:TtAgo能夠以DNA作為引導切割ssRNA、ssDNA和dsDNA;AaAgo可用ssDNA作為引導切割ssRNA;MjAgo利用ssDNA引導切割RNA;而RSAgo沒有催化活性,但是其在R. sphaeroides與核酸酶一起出現。原核生物Argonaute的這一特性使得其在原核生物的宿主防御中起著重要的作用。同時,有研究發現在Argonaute基因周圍、甚至同一操縱子下存在其他相關蛋白如核酸酶解旋酶,Argonaute切割核酸需要其他蛋白共同參與。

涉及韓春雨NgAgo相關研究,2014年Wang等在嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)的Argonaute蛋白(TtAGO)中發現了引導DNA的序列后,Swarts接著證明了TtAGO能夠引導DNA靶向結合DNA;2015年Swarts又發現Pyrococcusfuriosus的Argonaute(PfAgo)具有同樣的功能。遺憾的是,TtAgo和PfAgo都需要在大于65℃的條件下才具有切割反應。這就限制了其在哺乳動物中應用的可能性,所以并沒有引起人們足夠的重視。



當時科研人員仍在討論哺乳動物中的Argonaute能否binding DNA, 正反雙方都提出了很多觀點和假設。韓春雨在TtAgo和PfAgo這兩個基礎上通過在線比對工具PSI-BLAST比對與TtAgo和PfAgo同源性高的可能蛋白,最后發現在格氏嗜鹽堿桿菌(Natronobacterium gregoryi)中存在一個同源蛋白,宣稱經過一系列實驗后其認為這個蛋白能夠在37℃條件下實現DNA引導的哺乳動物細胞基因組編輯,并命名為NgAgo。



? ? 隨后,國際學術同行質疑是因為很多實驗室都無法重復出韓春雨的NgAgo類似實驗結果。






針對無法重復韓果的科學質疑,引起《自然-生物技術》調查,其編輯部發表關注、并發出必須答疑的最后通牒。?

? ? 盡管如此,另一個獨立實驗室發表非完整的數據表明:韓春雨的NgAgo具有RNA干擾功能,但無基因編輯。



4.?? 關于NgAgo實驗結果之推測

可以確定的是TtAgo、PfAgo以及NgAgo均屬于原核生物Argonaute核酸酶,結合原核生物中Argonaute的一些特點,筆者對NgAgo不能重復的原因提出幾種可能的推測:

第一,論文的結論正確之可能性很小,但其NgAgo靶向基因剪刀切割編輯效率極低,而無法重復可因為這個系統極不穩定(或韓春雨沒有公布某些關鍵數據之可能性幾乎為零)。假如原核的NgAgo正確,那哺乳動物細胞為何進化分化產生7-8個亞類、且各具有不同功能?假如原核的NgAgo具有哺乳動物基因編輯功能,人類進化過程中是否早已被古細胞給滅絕了?如NgAgo真有基因編輯功能,那未戴手套且吃喝在實驗室的韓春雨及其徒弟是否早已被該古細菌NgAgo編輯而變異了嗎?

第二,論文的結果半真半假,即NgAgo可以作用于mRNA降低蛋白質的表達水平,但不能作用于基因組,而韓春雨觀測到蛋白質水平下降后誤以為其是通過編輯基因組造成蛋白水平的改變,為了早點發出論文其偽造了部分測序數據,準備等文章發表之后再做。另外,也可能特殊條件下的假陽性結果,之后就連自己實驗室都無法重復其實驗結果。因此不一致性而致使韓春雨不敢公布原始實驗及其重復實驗的記錄。

第三,NgAgo并不能在哺乳動物中產生作用,需要特定的條件或輔因子,或者如前文提到的RsAgo一樣需要特定的蛋白輔助才能完成剪切,只有2個月完成部分特殊陽性結果,而別的實驗都主觀編造,因此致使國際所有實驗室無法重復。

第四,NgAgo實驗過程中有意或無意污染了CRISPR-Cas9,導致高效基因編輯功能。只要調查原始實驗材料與記錄即可弄清楚事實真相。

第五,NgAgo編輯哺乳動物細胞基因也可能存在原則常識性的邏輯錯誤,比如基因復制過程中產生大量岡崎(Okazaki)DNA片段,加之DNA受傷后也產生不少DNA片段,如此5'-磷酸化末端與3'-羥基末端DNA片段可以導引的話,那么哺乳動物細胞內Ago酶可隨時切割加工基因組,以致無限制性突變。但是,事實上不可能發生,因此如真有DNA片段超過一定限度就會誘導DNA-damage應答反應或siDNA效應。


最后不管如何,《自然-生物技術》雜志將在1月底結束調查,隨后就會公布調查結果。盡管大家對韓春雨NgAgo有著諸多質疑和批評,但是我們仍希望韓春雨的論文是實實在在的科研成果,而不是為了一時的名利而弄虛作假甚或為了達到四姨太效應而放黑衛星。畢竟,我們之所以如此是因為我們愛之深、責之切,大家都希望中國的科研能夠越做越好。當然,如果事實證明韓春雨確實是造假,我們也希望其能夠得到應有的嚴厲懲罰甚或判刑。只有踏踏實實做科研的人才是中國科研創新的未來。

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附相關的早期博文:

1)韓果事件即將結束,從另一視角回看100余位教授院士領導參與其中?

http://blog.sciencenet.cn/blog-2554763-1021416.html

2)一黃金編輯探討文: 理性評價"韓果”; 但絕不要"科學文革與民粹”

http://blog.sciencenet.cn/blog-2554763-989316.html

3)“韓果”然如此回答方舟子的質疑,能否建立學術嚴謹之權威性嗎?

http://blog.sciencenet.cn/blog-2554763-988867.html

4)科研創新有三大類:original, novel combination, & combination?

http://blog.sciencenet.cn/blog-2554763-990029.html

5)韓春雨推進了一熱門基因編輯技術,但毋須造神大師如施饒白三兄弟

http://blog.sciencenet.cn/blog-2554763-979665.html

6)中國諾獎級科學家,就吹吧!造神牛之草根科學家艱難的諾貝爾之路

http://blog.sciencenet.cn/blog-2554763-980509.html

7)直面方舟子質疑:中國諾獎級科研“韓果”如真,咋就不可重復呢?

http://blog.sciencenet.cn/blog-2554763-988368.html




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